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https://www.innovacioneducativa.unam.mx:8443/jspui/handle/123456789/7860| Título : | Enseñanza práctica del inducción y crecimiento de los ´raíces peludas´ en los plantas para la producción de los metabolitos secundaria y estudios de genómica funcional |
| Autor : | ARTHIKALA, MANOJKUMAR |
| Fecha de publicación : | 2020 |
| Resumen : | La Escuela Nacional de Estudios Superiores (ENES) unidad León de la UNAM oferta las licenciaturas en Ciencias Agrogenómicas; licenciatura que conlleva a una alta práctica y enseñanza científica en actividades de laboratorio, siendo los resultados esenciales para el desarrollo de su aprendizaje y formación durante la licenciatura. Dentro de la Licenciatura en Ciencias Agrogenómicas y el programa de posgrado en Ciencias Biológicas y Ciencias de la Sostenibilidad, el aprendizaje de ciencias básicas como lo son el Metabolismo Secundario, la Genómica Funcional, la Fisiología Celular, la Biología Celular y la Biología Molecular es esencial para el desarrollo de un mejor aprendizaje y formación de alumnos con un alto criterio científico. Cada año se desarrollan y mejoran nuevos enfoques de ingeniería genética y técnicas de genómica funcional. Estas herramientas tienen aplicación directa en el área de biotecnología, mejora de cultivos, análisis funcional de genes (mediante edición del genoma), plantas de ingeniería para la producción secundaria de metabolitos, en fitorremediación y para la producción de proteínas recombinantes (por ejemplo, los cultivos moleculares) para la industria de la salud, etc. Este tipo de conocimiento de frontera y enseñanza práctica es sumamente necesario para los programas de licenciatura y posgrado de ciencias en México. Este proyecto estandarizará protocolos reproducibles para la inducción transgénica de “raíces peludas” en plantas de cultivo; y también técnicas de análisis funcional para producir metabolitos secundarios y localizar proteínas objetivo. Finalmente, desarrollamos un manual que especifica protocolos para la producción secundaria de metabolitos y estudios de genómica funcional para la enseñanza práctica. De este modo, integra los temas de enseñanza y laboratorio de Genómica Funcional, Metabolismo Secundario, Fisiología Celular, Biología Celular y Biología Molecular en los grados de Ciencias Agrogenómicas. |
| URI : | https://www.innovacioneducativa.unam.mx:8443/jspui/handle/123456789/7860 |
| metadata.dc.contributor.responsible: | ARTHIKALA, MANOJKUMAR |
| metadata.dcterms.callforproject: | 2020 |
| metadata.dc.coverage.temporal: | 2020-2021 |
| metadata.dcterms.educationLevel: | nivel superior |
| metadata.dcterms.educationLevel.SEP: | Licenciatura |
| metadata.dc.description.objective: | Objetivo general: Diseñar protocolos para inducir y desarrollar 'raíces peludas' en plantas que producen metabolitos secundarios o analizar la función de un transgén como parte de la enseñanza-aprendizaje de las asignaturas: Metabolismo Secundario, Genómica Funcional, Fisiología Celular, Biología Celular y Biología Molecular para estudiantes de pregrado de Ciencias Agrogenómicas y Administración Agropecuaria; y estudiantes de posgrado de Ciencias Biológicas y Ciencias de la Sostenibilidad. Objetivos específicos: Establecer protocolos estandarizados y reproducibles para la inducción y el crecimiento de 'raíces peludas' en plantas que producen metabolitos secundarios (usando Catharanthus roseus como ejemplo) o analizar la función del transgén (raíces peludas transgénicas de frijol que muestran la localización subcelular de la proteína BYPASS1). Brindar capacitación a estudiantes de Licenciatura, posgrado y profesores en la producción y aplicación de “raíces peludas” en metabolismo secundario y la genómica funcional. Informar y transmitir el manual a los estudiantes y profesores de la UNAM, así como a otras universidades. Además, estos enfoques también pueden servir para desarrollar proyectos científicos básicos. |
| metadata.dc.description.strategies: | Crecimiento de plantas: Todo el experimento se realizará utilizando las semillas Phaseolus vulgaris y Catharanthus roseus. Las semillas de las plantas se esterilizarán superficialmente utilizando nuestro protocolo publicado anteriormente (Nanjareddy et al.2017). Se usarán plántulas de P. vulgaris en germinación de dos días para inducir raíces peludas. Se utilizarán plantas de C. roseus de 15 días para generar raíces peludas (Deng et al., 2011). Agrobacterium rhizogenes K599 se utilizará para generar las raíces peludas tanto en Phaseolus vulgaris como en Catharanthus roseus como se muestra en (Nanjareddy et al.2017; Deng et al., 2011). Procedimiento de aislamiento para alcaloides de indólicos: se realizarán cultivos de raíces peludas de Catharanthus roseus L. inducidos por Agrobacterium rhizogenes según Hanafy et al., (2017). La extracción, el fraccionamiento y la purificación de compuestos alcaloides indólicos se realizarán de acuerdo con Martin y colaboradores (2015) utilizando cromatografía líquida al vacío y cromatografía líquida de alta presión (HPLC). Localización subcelular: Usaremos la clonación de las secuencias codificantes fusionadas con proteínas fluorescentes (proteína amarilla fluorescente) para conocer su localización en el sistema de raíces transgénicas de frijol. Usaremos los genes (Ejamplo BYPASS1 de frijol) previamente clonados de nuestro laboratorio (Arthikala et al.2017 Frontiers in Plant Science 8: 2003.) para demostrar la localización sub-celular. Las raíces transgénicas que expresan BYPASS1 se seleccionarán en base a la proteína folurescente amarilla (YFP) bajo un microscopio epifluorescente. Preparación del manual de prácticas: Durante la inducción y el desarrollo de las raíces peludas de Catharanthus roseus y Phseolus vulgaris se tomarán fotografías y grabaciones de video que completarán gráficamente el manual de prácticas de laboratorio. De manera similar, la extracción e identificación del metabolito secundario (alcaloides indólicos) y la demostración de la localización subcelular de la proteína BYPASS1 se documentarán sistemáticamente (videos e imágenes) para el desarrollo del manual de laboratorio. El manual contendrá las siguientes secciones: Portada, índice y prácticas. Para cada práctica: objetivos, introducción, materiales y métodos, conclusión, relevancia científica, autoevaluación y referencias bibliográficas. El manual contendrá protocolos estandarizados y reproducibles que describirán en detalle los pasos a seguir. Durante cada práctica, los estudiantes adoptarán el procedimiento para resolver problemas experimentales inmediatos en las prácticas. Además, el alumno debe haber obtenido previamente conocimientos teóricos para llevar a cabo la práctica y vincularlos con la experimentación. Una vez que se obtienen los resultados, estos serán analizados e interpretados para generar grupos de discusión entre los participantes, generar conclusiones y resaltar la relevancia científica que se reflejará en los informes de práctica. BIBLIOGRAFÍA: Arthikala MK, Jesús Montiel, Rosana Sánchez-López, Noreide Nava, Luis Cárdenas, and Carmen Quinto (2017). Respiratory burst oxidase homolog gene A is crucial for Rhizobium infection, nodule maturation and functioning in common bean. Frontiers in Plant Science 8:2003. Deng, Y., Mao, G., Stutz, W., & Yu, O. (2011). Generation of composite plants in Medicago truncatula used for nodulation assays. Journal of visualized experiments : JoVE, (49), 2633. Hanafy M.S., Matter M.A., Rady M.R. (2017) Production of Indole Alkaloids in Catharanthus roseus L. Hairy Root Cultures. In: Malik S. (eds) Production of Plant Derived Natural Compounds through Hairy Root Culture. Springer, Cham. Martin, N. J., Nicolas, M., Lecellier, G. and Raharivelomanana, P. (2015). Isolation and Characterization Procedure for Indole Alkaloids from the Marquesan Plant Rauvolfia Nukuhivensis. Bio-protocol 5(20): e1625. Nanjareddy K, Arthikala MK, Aguirre AL, Gómez BM, Lara M (2017). Plant promoter analysis: Identification and characterization of root nodule specific promoter in common bean. Journal of Visualized Experiments (130), e56140. Thakore D, Srivastava AK, Sinha AK (2013) Yield enhancement strategies for enhancement of indole alkaloids in hairy root cultures of Catharanthus roseus. Int J Chem Eng Appl 4:153–156. |
| metadata.dc.description.goals: | Las metas del presente proyecto son: 1. Establecer protocolos estandarizados y reproducibles para la inducción y el crecimiento de "raíces peludas" en las plantas. Se utilizarán las siguientes dos plantas a) Catharanthus roseus rico en alcaloides indólicos utilizados para producir metabolitos secundarios. b) Phaseolus vulgaris se utilizará para demostrar la localización subcelular de la proteína BYPASS1. 2. El manual de prácticas se elaborará en formato electrónico que será complementado con el soporte de imágenes y videos representativos, como un complemento en el mejoramiento del proceso enseñanza-aprendizaje y tener una amplia difusión de este. 3. Incluir los protocolos en un manual de prácticas de laboratorio para aplicación en las asignaturas relacionadas a el Metabolismo Secundario, Genómica Funcional, Fisiologia Celular, Biología Celular y Biología Molecular, entre otras para estudiantes de la Licenciatura y Posgrado. 4. Se impartirá capacitación a estudiantes de Licenciatura, Posgrado y profesores en la producción y aplicación de raíces peludas y su aplicación en metabolismo secundario y genómica funcional. 5. Los estudiantes presentarán los nuevos protocolos desarrollados a la comunidad científica por medio de congresos nacionales. |
| metadata.dc.description.selfAssessment: | Cada año se han desarrollado y mejorado nuevos enfoques de ingeniería genética y técnicas genómicas funcionales. Estas herramientas tienen aplicación directa en el área de biotecnología, mejoramiento de cultivos, análisis funcional de genes, plantas de ingeniería para la producción de metabolitos secundarios, en fitorremediación y para la producción de proteínas recombinantes para la industria de la salud, etc. Este tipo de conocimiento y enseñanza práctica de frontera es muy necesario para los programas de Licenciatura y posgrado de ciencias en México. Para lograrlo, propusimos este proyecto que estandariza protocolos reproducibles para la inducción de raíces pilosas transgénicas en plantas de cultivo; y también, técnicas de análisis funcional para producir metabolitos secundarios y localizar proteínas diana. Hemos estandarizado el protocolo de transformación de raíces peludas mediado por Agrobacterium rhizogenes en un solo paso para Catharanthus y Phaseolus. El nuevo método desarrollado utiliza tallos jóvenes (para Catharanthus y cacahuete) o plántulas de 2 días (para Phaseolus) como ex-plantas. Las ex-plantas se infectan con cultivo reciente de A. rhizogenes que alberga el gen marcador. La vermiculita estéril con solución nutritiva se utiliza como medio. Curiosamente, Phaseolus y el cacahuete muestran 2 semanas para generar raíces peludas de más de 2 cm, mientras que Catharanthus tardó 5 semanas. Las eficiencias de transformación fueron 33%, 86% y 93% respectivamente para Catharanthus, Phaseolus y cacahuete. Además, hemos demostrado la localización subcelular de dos genes, a saber, SnRK1 y AGL8 utilizando el vector binario pErlyGATE104 con la fusión N-terminal. Estas técnicas de generación de raíces peludas fueron incluidas y enseñadas a los alumnos (tanto teóricos como de laboratorio) de las asignaturas de Metabolismo Secundario y Genómica Funcional de la carrera Licenciatura en Ciencias agrogenómicas. Los conocimientos prácticos adquiridos con la formación de estas técnicas tienen una gran utilidad en otras áreas de investigación como la Fisiología Celular, la Biología Celular y la Biología Molecular. Algunos estudiantes de último año de la ENES Unidad León y la Universidad de La Ciénega del Estado de Michoacán de Ocampo realizan sus investigaciones utilizando estos protocolos para analizar la función de nuevos genes. Además, el presente proyecto desarrolló los siguientes productos con los debidos reconocimientos al PAPIME - PE212520. 1) Dos estudiantes hicieron servicio social. 2) Una tesis de Licenciatura. 3) Dos estudiantes presentados en una conferencia internacional como primeros autores. 4) Protocolo de laboratorio para prácticas de diferentes asignaturas de la Licenciatura en Ciencias Agrogenómicas. 5) Publicado un capítulo del libro. 6) Se publicará un artículo de protocolo en una revista internacional de acceso abierto. La publicación se encuentra en revisión en la revista internacional ´Applications in the Plants´. |
| metadata.dc.description.goalsAchieved: | 1) Hemos estandarizado el protocolo de transformación de raíces peludas mediado por Agrobacterium rhizogenes en un solo paso para Catharanthus y Phaseolus. El nuevo método desarrollado utiliza tallos jóvenes (para Catharanthus y maní) o plántulas de 2 días (para Phaseolus) como ex-plantas. Las ex-plantas se infectan con cultivo reciente de A. rhizogenes que alberga el gen marcador. La vermiculita estéril con solución nutritiva se utiliza como medio. Curiosamente, Phaseolus y el maní muestran 2 semanas para generar raíces peludas de más de 2 cm, mientras que Catharanthus tardó 5 semanas. Las eficiencias de transformación fueron 33%, 86% y 93% respectivamente para Catharanthus, Phaseolus y maní. Además, hemos demostrado la localización subcelular de dos genes, a saber, SnRK1 y AGL8 utilizando el vector binario pErlyGATE104 con la fusión N-terminal. 2) El protocolo estandarizado que hemos desarrollado en el presente proyecto se elaboró en forma de artículo de protocolo (en lugar de manual) para publicarlo en una revista internacional de acceso abierto para una mayor accesibilidad y utilidad a los diversos grupos de investigación científica de todo el mundo. La publicación se encuentra en revisión en la revista internacional ´Applications in the Plants´. Además, estas técnicas de generación de raíces peludas fueron incluidas y enseñadas a los alumnos (tanto teóricos como de laboratorio) de las asignaturas de Metabolismo Secundario y Genómica Funcional de la carrera Licenciatura en Ciencias Agrogenómicas. 3) Los conocimientos prácticos adquiridos con la formación de estas técnicas tienen amplia utilidad en otras áreas de investigación como Metabolismo Secundario, Genómica Funcional, Fisiología Celular, Biología Celular y Biología Molecular. Algunos estudiantes de último año de la ENES unidad León y la Universidad de La Ciénega del Estado de Michoacán de Ocampo (UCEMO) realizan sus investigaciones utilizando estos protocolos para analizar la función de nuevos genes. 4) Se capacitó a estudiantes de varios grupos de la ENES unidad-León en la generación de raíces peludas para análisis funcional de genes en diferentes plantas. Dos estudiantes llevados al servicio social para trabajar en la localización de genes y el análisis de promotores utilizando el enfoque de raíces peludas en Phaseolus. Un alumno participante de este Proyecto, realizó su trabajo de tesis y presentó la tesis en UCEMO, México en el año 2021. Por otro lado, varios grupos de estudiantes de Ciencias agrogenómicas, ENES unidad-León fueron capacitado en la evaluación de metabolitos secundarios en diferentes plantas silvestres. 5) El protocolo desarrollado de raíces peludas en frijol se utilizó para evaluar la función genética de AGL8 y SnRK1. La localización subcelular de SnRK1 y AGL8 se determinó usando el vector binario pErlyGATE104 con la fusión N-terminal. Los resultados fueron presentados como una presentación oral por dos estudiantes en una conferencia internacional ViRACBS-2020. |
| metadata.dcterms.provenance: | Escuela Nacional de Estudios Superiores Unidad León (ENES León) |
| metadata.dc.subject.DGAPA: | Biotecnología Genómica |
| metadata.dc.type: | Proyecto PAPIME |
| Aparece en las colecciones: | 2. Área de las Ciencias Biológicas, Químicas y de la Salud |
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