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https://www.innovacioneducativa.unam.mx:8443/jspui/handle/123456789/7825| Título : | Guía para la enseñanza y el estudio de la genómica comparativa de Felinos. Obtención del Transcriptoma de referencia de Leopardus pardalis. |
| Autor : | TAPIA LOPEZ,ROSALINDA |
| Fecha de publicación : | 2021 |
| Resumen : | El mapa curricular de la licenciatura en Biología de la UNAM no incluye como asignaturas de tronco común u optativas, disciplinas como Bioinformática, Genómica y biología de sistemas; sin embargo, debido a la pertinencia de las tecnologías de secuenciación masiva como estrategias indispensables en la actualidad para los biólogos, el presente proyecto tiene como objetivo central el diseño y desarrollo de una guía para la enseñanza y el estudio de la genómica, analizando como grupo de estudio a los Felinos, mediante la obtención del Transcriptoma de referencia de Leopardus pardalis. Una especie amenazada de la cual no se dispone de información genómica más allá de su genoma mitocondrial; por lo que la obtención del transcriptoma de referencia de este organismo aportará información esencial para el estudio de su historia evolutiva y para su conservación. Nos enfocaremos en el diseño y desarrollo de tres manuales completos, que servirán de apoyo a los docentes en la enseñanza de la genómica y la bioinformática dentro de las asignaturas de Biología Molecular de la Célula, genética, La Biología del Desarrollo en la Era Genómica, Temas Selectos del Núcleo Celular, Mastozoología, El Zoológico como Centro de Conservación y biología Animal. Dichos manuales integran la Guía para la enseñanza y el estudio de la genómica comparativa de Felinos, los cuales se integran como se enlista a continuación: A) Manual de manejo de Leopardus pardalis en cautiverio para la toma de muestras de sangre B) Manual de Biología Molecular para la secuenciación masiva de muestras de sangre. C) Manual de introducción a la Transcriptómica: Obtención del transcriptoma de referencia de Leopardus pardalis. |
| URI : | https://www.innovacioneducativa.unam.mx:8443/jspui/handle/123456789/7825 |
| metadata.dc.contributor.responsible: | TAPIA LOPEZ,ROSALINDA |
| metadata.dcterms.callforproject: | 2021 |
| metadata.dc.coverage.temporal: | 2021-2023 |
| metadata.dcterms.educationLevel: | nivel superior |
| metadata.dcterms.educationLevel.SEP: | Licenciatura |
| metadata.dc.description.objective: | Objetivo general: Contribuir al estudio, la enseñanza y la divulgación científica de estudios y análisis genómicos enfatizando el paradigma de la conservación de la Biodiversidad, a través de herramientas moleculares con la secuenciación masiva por RNA-Seq, la transcriptómica y disciplinas como la Bioinformática, en una especie no modelo y amenazada (L. pardalis). Objetivos específicos: "Diseñar, y desarrollar experimentos para la generación de datos y materiales y que servirán como apoyo en la educación formal de los alumnos de la licenciatura en Biología y alumnos de bachillerato, através de la generación de manuales y presentaciones por video. Motivar la vocación científica y la innovación en estudiantes de diferentes niveles mediante el acceso a los manuales, datos y materiales generados en el presente proyecto; a través del análisis de un caso de estudio específico. Promover entre la comunidad de estudiantes interesados en el estudio de las ciencias biológicas, dentro y fuera de la UNAM, la importancia de la conservación biológica, y la importancia de la genómica como disciplina en la conservación de las especies amenazadas. Difundir el conocimiento del manejo de metodologías de extracción de RNA, bioinformática para el anális de transcriptomas a través de la generación de manuales y videos con información clara y accesible para la comunidad a quién van dirigidos" |
| metadata.dc.description.strategies: | Primer año Diseño, planeación y ejecución de las primeras etapas correspondientes a las actividades a realizarse en los zoológicos (censado del sexo, edad y disponibilidad de ocelotes en los zoológicos públicos de la Ciudad de México y el resto del país), en el laboratorio y de los análisis bioinformáticas (esto últimos utilizando secuencias publicas disponibles en el Genebank). Se diseñarán y desarrollarán talleres virtuales (en video) acerca del manejo de ocelotes en cautiverio, para la toma de muestras biológicas. Se diseñarán y desarrollarán talleres virtuales (en video) acerca de las técnicas de secuenciación masiva por RNA-Seq. Y acerca del análisis de calidad y ensamblado de transcriptoma de novo. Se realizarán talleres virtuales (en video) acerca de la anotación de transcriptoma de novo y acerca del análisis de expresión diferencial a partir de bibliotecas de RNAseq. Se realizarán salidas al campo para la colecta de muestras de sangre de ocelotes machos y hembras de distintas edades, en los zoológicos seleccionados previamente. Se realizará un protocolo de la obtención y él envió del RNA total de las muestras de sangre colectadas, para la generación de la biblioteca para RNA-Seq Se realizará un taller virtual de extracción de RNA total a partir de muestras de sangre. Se realizará un manual de prácticas de Biología Molecular para la obtención de RNA total a partir de muestras de sangre. Segundo año Se realizará un protocolo del análisis de la calidad de las bibliotecas de RNA-Seq obtenidas en el presente proyecto. Se realizará de un protocolo de ensamble de novo del transcriptoma de Leopardus pardalis Se realizará un protocolo de la anotación del transcriptoma de novo de Leopardus pardalis Se realizará un protocolo de análisis de expresión génica de los ocelotes hembras y machos de distintas edades. Se realizará un manual de los análisis bioinformáticos para el análisis de calidad de las bibliotecas y la obtención, anotación y análisis de expresión génica del transcriptoma de novo de Leopardus pardalis. Se realizará un protocolo para subir las bibliotecas de RNA-Seq al Genebank Se realizará la distribución de los manuales generados en el presente proyecto. Métodos Obtención de RNA total Para la extracción de RNA de Leopardus pardalis machos y hembras de distintas edades se probará un protocolo tomando como base el protocolo descrito por Valderrama-Cháirez et al., 2002. La calidad y cantidad del RNA será verificada, previamente a la generación de las bibliotecas de cDNA, con la ayuda del BioAnalyzer, esperando valores de RIN cercanos a 8. Generación y secuenciación de bibliotecas de cDNA. La generación y secuenciación de las bibliotecas de cDNA se llevará a cabo en la Unidad Universitaria de Secuenciación Masiva y Bioinformática del Instituto de Biotecnología de la UNAM. En total se realizará la construcción de 3 biblioetecas con 100 Millones de lecturas por por muestra (para generar el transcriptoma de referencia), y 12 bibliotecas para el ensayo de expresión diferencial (comparando 3 bibliotecas de machos jovenes y 3 bibliotecas de machos adultos, contra 3 bibliotecas de hembras jovenes y 3 bibliotecas de hembras adultas). Posteriormente se realizará la secuenciación de las bibliotecas de cDNA, utilizado la plataforma de illumina NextSeq 500 NS500560, de tipo pair End. Ensamblado del transcriptoma de Novo de Leopardus pardalis. Se llevará a cabo el análisis de la calidad; el análisis de calidad de las lecturas será realizado utilizando el software FastQC. Finalmente, se realizará el ensamble del transcriptoma de Novo, utilizando el software Trinity 2.4, empleando los parámetros establecidos por el software. Para evaluar la calidad el ensamble obtenido se estimarán los valores N50, ExN50 y L50, utilizando las funciones del paquete de Trinity. Una vez generado el ensamble, se evaluará la completitud de los transcritos con el software BUSCO. Posteriormente la anotación de los transcritos obtenidos se realizará con el software Trinotate. Cuantificación de los transcritos obtenidos, análisis de expresión diferencial Para realizar la cuantificación de los transcritos se empleará un método basado en el mapeo de las lecturas dentro del transcriptoma ensamblado, como parte del pipeline de Trinity utilizando el software Bowtie2, y posteriormente utilizando RSEM. Con los resultados arrojados por RSEM, con las abundancias para cada condición, por transcrito, se realizará una tabla de conteos. El análisis de expresión diferencial y la integración de resultados, se llevará a cabo a través del sitio web IDEAMEX (Jimenez-Jacinto et al, 2019), utilizando los métodos DESeq (Anders y Huber, 2010), DESeq2 (Love et al., 2014), EdgeR (Robinson et al., 2013) y NOISeq (Tarazona et al., 2011). Para seleccionar los genes diferencialmente expresados se usará un padj <= 0.04, FDR <= 0.04 y prob >=0.96, para DESeq/DESeq2, edgeR y NOISeq, respectivamente y un logFC >= 2 en valor absoluto. |
| metadata.dc.description.goals: | Primer año:Convocar a estudiantes de licenciatura en Biología a los talleres de manejo y toma de muestra en ocelotes en cautiverio. Convocar a estudiantes de la licenciatura en Biología al taller de Biología Molecular. Convocar a estudiantes de la licenciatura al taller de bioinformática. Realizar de forma exitosa la toma de muestras biológicas. Realizar de forma exitosa la obtención de RNA total a partir de las muestras biológicas Redactar y editar el manual de manejo de ocelotes y de toma de muestras biológicas Redactar y Editar el Manual de Biología Molecular. Segundo año: "Obtener de forma exitosa las bibliotecas de RNA-Seq de Leopardus pardalis Obtener el transcriptoma de Leopardus pardalis Redactar y editar el manual de análisis bioinformático de las bibliotecas de Leopardus pardalis Publicar las bibliotecas de RNA-Seq de Leopardus pardalis en el Genebank Realizar la distribución de los manuales generados en el presente proyecto, asegurando su disponibilidad para los estudiantes y los profesores de la Licenciatura en Biología de la UNAM." |
| metadata.dc.description.selfAssessment: | Como parte de la autoevalución que hemos hecho, consideramos que logramos obtener y cumplir los objetivos y metas planteadas de manera importante. Tuvimos que replantearnos objetivos y metas, al darnos cuenta que en la evaluación inicial de proyecto se nos señaló, que el proyecto parecía estar más encaminado a un proyecto de investigación que de apoyo a la docencia, movimos los esfuerzos a lograr tener un proyecto que involucrara más la formación de recursos humanos de alta calidad y ajustamos el proyecto al presupuesto asignado. Realizamos trabajo de campo para la colecta de material biológico en dos instituciones muy interesantes encargadas del manejo de fauna silvestre incautada o accidentada encargada por la PROFEPA y la SEMARNAT. Establecimos colaboraciones para plantear estrategias de conservación de especies de felinos pequeños y medianos emblemáticos desde un enfoque genético, con dichas instituciones Logramos organizar cursos y talleres que beneficiaron a más de 70 personas, alumnos de las carreras de Biología, Medicina Veterinaria, y otras carreras de la UNAM y de otras universidades del país. Con el material colectado realizamos experimentos de extracción de DNA y RNA, electroforesis, amplificación por PCR de marcadores moleculares y análisis de secuencias sanger. También trabajamos en la elaboración de una biblioteca genómica, que fue secuenciada en la plataforma Illumina MiSeq, la cual sirvio para hacer análisis bioinformáticos para ensamblar dicho genoma, que posteriormente fue subido al genebank. Toda esta parte experimental nos ayudo de gran manera a presentar cursos muy completos y con información vigente a los estudiantes de los diferentes cursos impartidos, con los que podemos realizar estudios evolutivos y de genética de la conservación. LIMITACIONES: Nos enfrentamos a un proyecto muy interesante pero que de manera inicial se enfrento a cuarentena por Covid, lo que nos limito en un inicio a tener más interacción con diferentes grupos de trabajo con los que nos hubiera gustado también colaborar. También ajustamos la parte expertimental a la elaboración y ensamblaje de un genoma de Leopardus pardalis y no a análisis transcriptomicos, todo ésto derivado de los ajustes presupuestales y críticas al proyecto. Todo esto sin modificar drasticamente el espiritu de este proyecto. Por lo que consideramos que tuvimos un buen balance y mucho aprendizaje de las actividades desarrolladas. Así mismo tenemos tanto productos derivados de los experimentos como los generados para apoyar a diferenets programas de docencia a nivel locencitura e inclusive posgrado. |
| metadata.dc.description.goalsAchieved: | •Convocamo a estudiantes de licenciatura en Biología, medicina veterinaria y carreras afines a los talleres de manejo y toma de muestra en ocelotes en cautiverio, Biología Molecular y Bioinformática. En 2021 y 2022, impartimos talleres y cursos a estudiantes, becarios, prestadores de servicio social, de la Fundación Invictus AC, de la materia de “El zoológico como centro de conservación” Facultad de Ciencias UNAM, y de la UMA Selva Teneek. Los talleres se encuentran en en la plataforma YouTube (en el canal del presente proyecto PAPIME). Cosideramos que el estos cursos han beneficiado a estudiantes de ciencias biológicas y medicina veterinaria y zootecnia de diferentes instituciones •Realizar de forma exitosa la toma de muestras biológicas. Realizamos dos salidas de campo para la colecta de material biológico. En julio 2021 a la Fundación Invictus A. C. en Hidalgo, y en julio de 2022 a la UMA Selva Teneek A. C. en San Luis Potosí. Realizamos la toma de muestras de sangre y pelo, y registro de datos biométricos de un Ocelote y un Jaguarundi , y dos jaguares. En la segunda salida de campo (Julio 2022), colectamos por métodos no invasivos pelo de Ocelote, Jaguarundi, tigrillo, puma y lince. Para preservar las muestras se utilizaron distintos métodos, sangre: congelación directa en nitrógeno líquido, preservación en soluciones de protección y almacenamiento de ácidos nucleicos (RNA later), también se almacenaron en Trizol Reagent. La sangre se preservó también enTubos Vacutainer-EDTA. Las que las muestras de pelo se preservaron en nitrógeno líquido y/o en sobres de papel a temperatura ambiente. •Realizar de forma exitosa la obtención de RNA total a partir de las muestras biológicas. Realizamos la extracción de RNA, a partir de las muestras de sangre colectadas de Leopardus pardalis. Probamos exitosamente dos protocolos de extracción de RNA, el primero utilizando un kit de extracción comercial Ambion Invitrogen™ PureLink™ RNA Mini Kit Life Technologies (Ambion), y el segundo utilizando un reactivo diseñado para la extracción de RNA, denominado TRIzol Reagent (Invitrogen). Así mismo se realizó la extracción de DNA de las muestras colectadas de las especies ocelote, jaguarundi, tigrillo, puma y lince. •Redactar y editar el manual de manejo de ocelotes y de toma de muestras biológicas. Redactamos los manuales de Manejo de felinos en cautiverio y el manual de Biología Molecular, y bioinformática mismos que se anexan como probatorios. •Obtener de forma exitosa las bibliotecas de RNA-Seq, Transcriptoma de referencia y Publicación de las bibliotecas de RNA-Seq de Leopardus pardalis en el Genebank. En su lugar obtuvimos bibliotecas genómicas que se secuenciaron en plataforma Miseq-Illumina, se ensamblaron y publicaron en el genbank-NCBI, número de registro SRR24091739, Bioproyecto SRR2409173. -Se redactaron los 3 manuales comprometidos, los cuales serán publicados una vez que sean aprobados en este informe. |
| metadata.dcterms.provenance: | Instituto de Ecología |
| metadata.dc.subject.DGAPA: | Biotecnología genómica |
| metadata.dc.type: | Proyecto PAPIME |
| Aparece en las colecciones: | 2. Área de las Ciencias Biológicas, Químicas y de la Salud |
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