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https://www.innovacioneducativa.unam.mx:8443/jspui/handle/123456789/4878
Título : | Diseño, implementación y prueba de una práctica que demuestre la relación genotipo-fenotipo a través de la determinación de los RFLP |
Autor : | Rodriguez Sotres, Rogelio |
Fecha de publicación : | 2015 |
Resumen : | Los polimorfismos de un solo nucleótido (SNPs por sus siglas en inglés) son modificaciones en la secuencia de ADN en las que un único nucleótido se ve alterado. Estas modificaciones pueden darse en la región codificante de un gen, en cuyo caso la secuencia de aminoácidos para la que codifica el gen podría cambiar, generando una proteína con un residuo de aminoácido diferente. Dentro de la población humana, hay millones de variaciones en forma de SNP y otras ocasionadas por otros procesos que en conjunto producen las diferencias genéticas que se manifiestan en la variedad de características encontradas dentro de los humanos como el color de los ojos, estatura, las alergias a ciertos medicamentos, ó alimentos, entre otras1. Para localizar las secuencias variables y las que son constantes en el genoma humano, la tecnología del DNA recombinante se ha desarrollado en forma muy importante, una de las técnicas que forma parte de esta tecnología es la del DNA fingerprinting que se utiliza para encontrar diferencias en el tamaño de las secuencias repetidas en tándem (short tandem repeat sequences) las cuales se localizan en una región específica de un cromosoma. En la población humana existen múltiples variantes en la longitud de estas secuencias, muchas de éstas ya han sido caracterizadas. Dentro de la técnica de DNA fingerprinting y de la identificación de las SNPs, se utiliza la técnica de PCR (del inglés polimerase chain reaction) reacción en cadena de la polimerasa. Es una de las técnicas de análisis de ADN más usadas Esta técnica permite amplificar un fragmento definido de ADN, para producir millones de copias a partir de unas cuantas moléculas de ADN intacto. Dicha reacción, se puede llevar a cabo de manera sencilla, económica y reproducible, y con los controles adecuados, los resultados pueden dar información muy valiosa en campos tan diversos como la medicina forense, análisis de paternidad, diagnóstico y seguimiento de pacientes, el Proyecto del Genoma Humano, identificación de los genes que provocan enfermedades genéticas, entre muchos otros. Dada la utilidad de esta técnica, es entendible que sea una de las técnicas de la tecnología del DNA recombinante más utilizada en campos muy diversos como los arriba mencionados,sin embargo no ha sido posible implementar una práctica de PCR en el laboratorio de Bioquímica Experimental. Encontramos que muchas universidades en el mundo 4, 5 , han implementado esta práctica en los cursos de licenciatura y en ferias científicas, se dan cursos de PCR a estudiantes de 16 a 18 años, por ello, es indispensable que esta práctica se establezca como permanente en el curso de Bioquímica Experimental. Con este objetivo en mente, se decidió proponer una práctica de manejo de la técnica de PCR, la cual consiste en usar la PCR para amplificar un fragmento del gen TAS2R38, con ello se identificará el genotipo relativo a un receptor de sabores de los estudiantes, el receptor a un compuesto químico llamado feniltiocarbamida (FTC). El gen TAS2R38 codifica para un receptor de sabor, el cual se encuentra localizado en la lengua y es responsable de la percepción del sabor amargo tanto en los humanos como en los chimpancés. La mayoría de la población humana reconoce al sabor del FTC como amargo; sin embargo, un porcentaje significativo de la población es incapaz de percibir al FTC. Se descubrió que la imposibilidad de detectar FTC es una característica recesiva; la habilidad para detectarlo correlaciona con un haplotipo de TAS2R38 que contiene tres SNPs y por lo tanto, de sus resultados se puede predecir con un 85% de variación el genotipo del sujeto experimental. Una de las misiones de la Facultad de Química, es la de que El profesorado mantendrá el uso de metodologías de enseñanza-aprendizaje modernas y diversas, asegurando la mejora continua de la infraestructura y la alta calidad de los recursos humanos. 2. Por ello, pensamos que por medio de ésta práctica se se cumpla esta misión ya que asemeja |
URI : | http://132.248.161.133:8080/jspui/handle/123456789/4878 |
metadata.dc.contributor.responsible: | Rodriguez Sotres, Rogelio |
metadata.dcterms.callforproject: | 2015 |
metadata.dc.coverage.temporal: | 2015-2016 |
metadata.dcterms.educationLevel: | nivel superior |
metadata.dcterms.educationLevel.SEP: | Licenciatura |
metadata.dc.description.objective: | 1) Investigar las técnicas apropiadas para estudiar la relación fenotipo y genotipo. 2) Diseño de los objetivos de aprendizaje de la práctica planteada del estudio de la relación genotipo-fenotipo. Un polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción (RFLP) en el gen TAS238, puede predecir la habilidad para detectar el sabor amargo del PTC (feniltiocarbamida). 3) Escritura de la práctica, así como la elaboración de problemas y preguntas acerca de ella. 4) Montaje de las metodologías que se utilizarán en la práctica por los profesores. 5) Análisis de los resultados obtenidos y ajuste de los métodos y corrección de los problemas observados. 6) Realizar la práctica por estudiantes de servicio social a manera de piloto. 7) Discusión con los estudiantes varios aspectos de la práctica: i) ¿Cómo se sintieron realizando el trabajo? ii) ¿Qué aspectos de la metodología piensan que deberían incluirse, eliminarse ó cambiarse? iii) Qué partes ó aspectos encontraron más interesantes? iv)Discusión de las preguntas y de los problemas. v) Evaluación de su aprendizaje. 8) Posteriormente, se implementará la práctica con 2 grupos de bioquímica experimental, siguiendo el protocolo antes desarrollado. Terminada esta etapa se afinarán los detalles que se hayan detectado durante la prueba. 9)Se redactará la práctica final para su incorporación al manual de prácticas de bioquímica experimental. 10)En esta etapa, se probar la eficacia de la práctica en cuanto a la comprensión de varios conceptos que se enseñan en Genética y Biología molecular, como son: alelo, hetericigoto, homocigoto, haplotipo, genes recesivos y dominantes. 11)Aplicación de un examen pretest y post-test para lo anteriormente mencionado. 12) Impartición de un taller práctico acerca de la elaboración de la práctica a los profesores de Bioquímica Experimental. |
metadata.dc.description.hypothesis: | La intensidad del sabor amargo de la feniltiocarbamida detectada, correlacionará con los alelos del TAS2R38. |
metadata.dc.description.strategies: | Obtener el fenotipo del alumno para la detección del sabor de la feniltiocarbamida. Aislar ADN genómico del alumno. Usar la PCR para amplificar un fragmento del gen TAS2R38. Digerir el fragmento amplificado y analizar los resultados de la digestión empleando electroforesis en gel de agarosa. Metodología en detalle: 1. Enjuagar vigorosamente la boca con 10 mL de solución salina. 2. Recuperar la solución salina en un vaso desechable limpio. 3. Tomar rápidamente 1 mL de esta solución y pasarla a un microtubo de 1.5 mL debidamente etiquetado. 4. Centrifugar el tubo a velocidad máxima en una microcentrífuga por 90 segundos. Descartar el sobrenadante cuidando que no se desprenda el botón. 5. Verificar que el tamaño del botón sea similar al de la cabeza de un cerillo. Si es menor, añadir otro mililitro del enjuague, y volver a centrifugar. 6. Una vez que se tenga un botón del tamaño deseado, usar el volumen que quede de sobrenadante para resuspender las céulas pipeteando suavemente de arriba a abajo la solución salina. 7. Tomar 30 uL de la suspensión celular y añadirlos a otro microtubo que contenga 100 uLde Chelex. Este tubo se pone a incubar en un bloque térmico a 99°C por 10 min. NOTA: ESTE MOMENTO SE APROVECHA PARA QUE LOS ESTUDIANTES PRUEBEN EL PAPEL CON FTC, Y QUE ANOTEN EL SABOR QUE DETECTARON. SE RECOMIENDA QUE PRUEBEN PRIMERO UN PAPEL CONTROL, SIN FTC, Y LUEGO EL PAPEL EMBEBIDO EN EL FTC. 8. Después de la incubación, se agita en el vórtex vigorosamente la suspensión celular, y se centrifuga a velocidad máxima por 90 segundos. 9. El sobrenadante se usa directamente en la reacción de PCR. Montarla según la siguiente tabla: Muestra1 uL Oligo Mix1 uL PCR Master Mix12.5 uL Agua milliQ10.5 uL Se pueden mezclar todos los reactivos menos la muestra en un volumen suficiente para todas las reacciones que se vayan a correr por grupo, más un 10% de exceso por si hay errores de pipeteo. NOTA: ESTOS VOLUMENES DEPENDERÁN DE LA ELECCIÓN DE REACTIVOS. SI SE COMPRA POR SEPARADO LA ENZIMA, dNTPs, MAGNESIO Y BUFFER, HABRÁ QUE ENLISTARLOS APARTE CON EL VOLUMEN ADECUADO. ADEMÁS, COMO SE PLANEA SOMETER EL RESULTADO DE LA REACCIÓN A UNA DIGESTIÓN, NO HAY QUE USAR REACTIVOS QUE INCLUYAN EL BUFFER DE CARGA PARA ELECTROFORESIS. 10. El tubo con la reacción de PCR se mete al termociclador y se corre el siguiente programa: 94°C 30 segundos 64°C 45 segundos 72°C 45 segundos Repetir 30 veces NOTA: Las condiciones del tiempo de incubación y de la temperatura de alineación se tendrán que optimizar. 11. Pasar 10 uL de la reacción de PCR a un tubo nuevo, al que se añadirá la enzima HaeIII, e incubar este tubo a 37°C por 1 hora. NOTA: APARENTEMENTE HaeIII PUEDE CORTAR EN EL MISMO AMORTIGUADOR DE LA PCR, LO QUE NOS AHORRARÍA EL TENER QUE PURIFICAR EL FRAGMENTO. 12. El resultado de la digestión se somete a una electroforesis en gel de agarosa al 2%, siguiendo el protocolo que ya se ha llevado a cabo en prácticas anteriores en el curso. Se recomienda correr dos controles con muestras previamente genotipificadas como homocigotas para ambos haplotipos, para que los estudiantes los comparen con su resultado. Comparando el resultado de todos los donadores de células, trate de predecir qué genotipo correlaciona con la sensibilidad a FTC. La secuencia de los oligos a usar es: 5-CCTTCGTTTTCTTGGTGAATTTTTGGGATGTAGTGAAGAGGCGG-3 (Forward Primer) 5'-AGGTTGGCTTGGTTTGCAATCATC-3' (Reverse Primer) De acuerdo a los resultados de la digestión, clasificar al donador como homocigoto o heterocigoto para los alelos del gen TAS2R38. Relacionar el genotipo del donador con su fenotipo relativo a la detección del sabor de la feniltiocarbamida. Determinación de la frecuencia alélica. |
metadata.dc.description.goals: | Metas para un año Al término de un año pretendemos haber montado la práctica Estudio de la relación genotipo-fenotipo. Un polimorfismo de longitud de fragmento de restricción (RFLP) en el gen TAS2R38, puede predecir la habilidad para detectar el sabor amargo del PTC (feniltiocarbamida). Obtención de la frecuencia alélica de los estudiantes de Bioquímica Experimental. Se habrá complementado el manual de prácticas de Bioquímica Experimental con la práctica mencionada arriba. Se habrá impartido un Taller para los profesores que imparten el curso de Bioquímica experimental. |
metadata.dc.description.selfAssessment: | Fue posible desarrollar una práctica que, conforme a lo planteado, ilustra la relación genotipo-fenotipo, a través de la medición de las frecuencias alélicas en una población humana con métodos modernos de la Biología Molecular. Dicha práctica fue aplicada en las etapas planteadas y los resultados fueron muy positivos. El protocolo desarrollado se acompaña de un documento depurado para que la práctica pueda implementarse de manera regular. Los profesores de enseñanza experimental de la bioquímica probaron el protocolo y lo consideraron valioso para apoyar la enseñanza de esta materia. Por tanto se considera que el proyecto se culminó con un éxito completo. |
metadata.dc.description.goalsAchieved: | Cumplimiento de objetivos: 1) Se realizó una investigación bibliográfica para determinar las técnicas más adecuadas a la enseñanza práctica del fenómeno de interés y luego se probaron las posibles formas de muestreo y purificación del DNA que resultaran adecuadas a las condiciones del laboratorio de enseñanza. 2) Se analizaron los objetivos de aprendizaje y se analizó su viabilidad y relevancia. 3) Ya se cuenta con un protocolo depurado de la práctica, que tiene el soporte de su aplicación (ver abajo) La práctica incluye preguntas previas y preguntas a posteriori que permite evaluar el desempeño de la práctica en el proceso de enseñanza. 4) Todas la metodologías necesarias para la práctica fueron montadas y probadas, incluyendo algunas alternativas. Aquellas de mejor desempeño y aplicabilidad fueron seleccionadas. 5) Se realizó el análisis de resultados y fue posible resolver todos los problemas para desarrollar una práctica funcional y útil. 6) Se probó con alumnos de servicio social. Este fue el primar paso de prueba de la práctica y resultó útil para mejorar la propuesta inicial. 7) Se realizó la discusión de los resultados y del trabajo realizado y esto se detalla en la sección de avances. 8) Se probó entonces, con dos grupos piloto de alumnos de la carrera de QFB inscritos a la materia de Bioquímica experimental (~unos 50 alumnos en total). De la respuesta de los alumnos y de los problemas observados durante su implementación se derivaron mejoras para el protocolo. 9) La práctica en su versión final ya está redactada y lista para su incorporación al acerbo de prácticas que los profesores de la materia pueden aplicar a la enseñanza de la Bioquímica experimental. Aunque la aplicación de este protocolo de manera regular no depende sólo de los participantes de este proyecto, el claustro de profesores de la materia ha aprobado ya la utilización regular de este protocolo de enseñanza en los siguientes semestres. 10) La evaluación del aprendizaje de conceptos se realizó con base en las respuestas a los cuestionarios y la participación durante la discusión. 11) Como se mencionó antes, el protocolo incluye preguntas previas, que luego se revalúan en un pos-test. 12) Finalmente, se aplicó en un taller para profesores de la materia, en la que los maestros tuvieron oportunidad de realizar el protocolo y evaluar sus beneficios posibles. La opinión general fue positiva. Cumplimiento de Metas: Se pudo Montar la práctica conforme a lo propuesto. Se pudo aplicar a la determinación de las frecuencias alélicas en los dos grupos de alumnos en que se probó, en forma piloto. El documento de la práctica quedó listo para subirlo al AMyD y que esté a disposición de los alumnos y profesores de la FQ. Se cumplió con la realización del taller, con resultados positivos. EN RESUMEN SE ALCANZARON CABALMENTE LOS OBJETIVOS Y SE CUMPLIÓ CON LA TOTALIDAD DE METAS. |
metadata.dcterms.provenance: | Facultad de Química |
metadata.dc.subject.DGAPA: | Bioquímica |
metadata.dc.type: | Proyecto PAPIME |
Aparece en las colecciones: | 2. Área de las Ciencias Biológicas, Químicas y de la Salud |
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