Transformación bacteriana de genes codificados en plásmidos

Abstract

El presente proyecto pretende generar un protocolo experimental sencillo y sin embargo de frontera, donde el alumno pueda observar y experimentar la transformación genética de plásmidos como uno de los fenómenos de transferencia horizontal de genes que se presentan en procariontes. Se pretende la aplicación y experimentación para el alumnado que cursa la asignatura de Microbiología Experimental (clave 1515), la cual es impartida durante el quinto semestre de la carrera y es obligatoria para los alumnos que se forman como Químico Farmaceútico Biológos y Químicos de Alimentos. Los estudiantes que cursan ésta, previamente han acreditado la asignatura teórica Microbiología General (clave 1410), en dicha asignatura la Unidad V del programa oficial comprende la genética microbiana, en donde se enfatizan los conceptos teóricos de la transferencia horizontal de genes y las consecuencias del este proceso para la diversidad microbiana, el surgimiento de nuevas cepas y su impacto en diversas áreas de importancia para el entorno. Estos procesos han tenido enorme impacto en el campo de la biotecnología donde nuestros estudiantes podrían realizar su ejercicio profesional, en este momento carecen de bases experimentales que les permitan aplicar los conocimientos de biología molecular e ingeniería genética que poseen solo en conocimientos teóricos. En los ejercicios experimentales que se realizan en la asignatura con clave 1515 se carece por completo de ejercicios experimentales para realizar una experiencia vívida de los fenómenos genéticos que pretende implementar este proyecto, en este contexto, solo un protocolo experimental se enfoca a la generación de mutantes al exponer cultivos microbianos bajo luz UV, el cual actualmente no tiene ninguna aplicación a nivel industrial y carece del concepto de la adquisición de nueva carga genética para el microorganismo. Con la implementación de los productos derivados de la presente propuesta se permitiría no únicamente modernizar los ejercicios experimentales, sino también ejemplificar por primera vez en el laboratorio microbiológico la transferencia horizontal de genes. El proyecto para el cual se pide el financiamiento tiene como objetivo que el alumnado experimente como se efectúa la transformación genética entre procariontes basándose en la adquisición por electroporación de un plásmido que contiene tanto el gen de resistencia a ampicilina, como el gen que codifica para la proteína verde fluorescente. Para lograr esta etapa se determinarán la fase de crecimiento óptima para la captación del plásmido. Así mismo, se propone la detección de esta adquisición mediante criterios fenotípicos. Al haber adquirido el plásmido la bacteria antes carente de él, ésta presentará los fenotipos de resistencia a ampicilina y un desarrollo morfocolonial fluorescente bajo la luz visible en placa de agar debido a la expresión del gen gfp y síntesis de la proteína verde fluorescente. Se decidió utilizar la aproximación antes mencionada ya que detectar la adquisición de un plásmido en bacterias previamente carentes de éste mediante lisis, extracción del material genético plasmídico y su secuenciación es complicado para la implementación en los grupos escolares que se manejan en esta asignatura debido a la alta densidad estudiantil, por lo que la detección fenotípica es una estrategia sencilla y altamente selectiva para evaluar el fenómeno de transformación. Durante el primer año de financiamiento se realizará la primera etapa de este proyecto y se pretende desarrollar y estandarizar la técnica de electroporación del plásmido, se cuenta en la actualidad con cepas de Salmonella Typhimurium que contienen este plásmido, por lo cual se obtendrá a partir de éstas la carga genética que se desea transformar. Se determinará el tiempo óptimo de incubación para que en una cepa de E. coli silvestre (la cual será la célula receptora del plásmido previamente extraído), se realice la transformación. Se plantea l